C18色譜柱的分離原理是基于反相色譜技術(shù)。在反相色譜中，填料表面是由親水基團（比如硅膠）修飾而成的，在有機溶劑中具有相對疏水性。而C18色譜柱中的填料表面經(jīng)過(guò)烷基化修飾，使其具有更高的疏水性。

在樣品溶液中，疏水性化合物的分子與填料表面的疏水區域相互作用較強，因而在色譜柱中停留時(shí)間較長(cháng)；而相對親水的化合物與疏水區域的相互作用較弱，因此在柱中停留時(shí)間較短。

因此，當樣品溶液通過(guò)C18色譜柱時(shí)，親水性化合物會(huì )較快地通過(guò)柱床，而疏水性化合物則較慢地通過(guò)。通過(guò)這種方式，不同化合物的分離可以實(shí)現。